摘要 为达到增殖菌体的目的，对粪肠球菌F71进行了培养基优化正交试验。结果表明，最佳培养基的组成为：胰蛋白胨10 g/L，酵母粉10 g/L，葡萄糖 10 g/L，无水氯化钙0.04 g/L，七水合硫酸镁0.019 2 g/L，磷酸氢二钾0.04 g/L，磷酸二氢钾0.04 g/L，磷酸氢钠0.4 g/L，氯化钠0.08 g/L，土豆汁50 g/L，碳酸钙1 g/L，乙酸钠10 g/L，碳酸铵2 g/L，乙酸铵1 g/L，半胱氨酸盐酸盐0.5 g/L，pH值为9，最适培养温度为35 ℃。用此培养基进行增殖，F71的最高活菌数达到2.78×108 cfu/mL，比基础培养基提高了54.6%。

　　关键词 粪肠球菌；F71；增殖；培养基；优化；活菌数

　　中图分类号 Q93-335 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2012）03-0035-02

　　Optimization of Multiplication Medium for Enterococcus faecalis F71

　　ZHOU Ying GAO Zi-lan YUAN Ling-nan ZHOU Jia-chun

　　（School of Biotechnology of East China University of Science and Technology，Shanghai 200237）

　　Abstract In order to realize the multiplication of isolates，the optimization experiment of medium for Enterococcus faecalis F71 was carried out by orthogonal design. The optimization of cultured medium of F71 was as follows：peptone 10 g/L，yeast extract 10 g/L，glucose 10 g/L，anhydrous calcium chloride 0.04 g/L，bitter salt 0.019 2 g/L，dipotassium hydrogen phosphate 0.04 g/L，monopotassium phosphate 0.04 g/L，monosodium phosphate 0.4 g/L，sodium chloride 0.08 g/L，juice of potato 50 g/L，calcium carbonate 1 g/L，sodium acetate 10 g/L，ammonium carbonate 2 g/L，ammonium acetate 1 g/L，cysteine hydrochloride 0.5 g/L. The optimal initial pH value of the medium was 9. F71 got to 2.78×108 cfu/mL in this culture for 16 hours at 35 ℃，and increased by 54.6% compared to the basic culture medium.

　　Key words Enterococcus faecalis；F17；multiplication；medium；optimazation；viable count

　　粪肠球菌是目前专用于微生物青贮接种剂主要菌种之一，并作为益生菌广泛用于畜牧生产中[1]，但对于粪肠球菌产多糖的研究较少。多糖具有降血脂、调节免疫功能、抗疲劳、抗辐射、抗肿瘤等作用，对于调节人体肠道功能具有明显效果，是一种较好的保健品添加剂。粪肠球菌胞外多糖在工业生产中由于其菌体产量低、容易降解而成为制约其大规模生产的瓶颈[2]，故菌体增殖为最基本的环节，筛选最适及效果最佳培养基，能够充分利用培养基营养基质，最大程度地提高单位活菌数，从而降低发酵成本[3]。本文对2株从自然环境中分离出来的粪肠球菌进行增殖培养研究，希望能为大规模工业化生产提供参考依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 试验材料

　　供试菌种：粪肠球菌F71，实验室提供。基础培养基（BM）：胰蛋白胨10 g、酵母粉10 g、葡萄糖10 g、无机盐溶液40 mL，溶解煮沸，冷却后加入半胱氨酸盐酸盐0.5 g，加蒸馏水定容至1 000 mL，调节pH值为7。无机盐溶液：无水氯化钙0.5 g、七水合硫酸镁0.24 g、磷酸氢二钾0.5 g、磷酸二氢钾0.5 g、磷酸氢钠5 g、氯化钠1 g，将氯化钙和硫酸镁混合在蒸馏水150 mL中直至溶解，加水250 mL。边搅拌边加入其他盐，至溶解，加蒸馏水至500 mL，于4 ℃保存备用。

　　1.2 试验方法

　　1.2.1 菌种活化与测定。将菌种用接种环从斜面上接种到5 mL的BM培养基中，37 ℃，220 r/min培养12 h，之后将种子液用50%甘油保种，使甘油的终浓度为25%，将甘油管放于 -20 ℃中保藏备用。活菌数的测定采用梯度稀释平板计数法。即在无菌操作条件下，吸取充分搅匀的培养液1 mL，加入9 mL的灭菌生理盐水中，制成10-1的均匀稀释液，再依次进行10倍递增稀释，至适当稀释度，吸取1 mL置于灭菌培养皿中，然后倒入约15 mL水浴至50 ℃左右的BM琼脂培养基中，摇匀待其凝固后于37 ℃厌氧培养箱中倒置培养24 h，采用菌落计数器进行计数。每次平行取样3次，取其平均值[4]。

　　1.2.2 最适培养温度的确定。分别在30、35、37、40 ℃的条件下培养40 h，定时取样进行测定。

　　1.2.3 最适初始pH值的确定。分别将培养基的初始pH值调至6、7、8、9，接种后在最佳温度条件下进行培养40 h，定时取样，确定最佳初始pH值。

　　1.2.4 营养因子的确定。在BM培养基中加入一定浓度的不同营养因子及碳氮源（土豆汁5%、萝卜汁5%、西红柿汁5%、平菇汁5%、乳糖1%、牛肉浸膏1%、玉米浆1%），在最适温度条件下进行培养，定时测定菌体浓度，确定最适营养因子的配方。

　　1.2.5 铵盐添加量的确定。BM中分别添加0.2%氯化铵、柠檬酸铵、乙酸铵、碳酸铵、磷酸二氢铵，确定铵盐对菌落的增殖效果。

　　1.2.6 缓冲盐试验。在100 mL的BM培养基中添加CaCO3 0.2 g、NaCH3COOH 0.5 g，定时测定菌数。

　　1.3 正交设计

　　采用4因素3水平正交试验方法，选取改良基础培养基中影响较大的4个因素，即初始pH值、土豆汁浓度、缓冲盐溶液及铵盐浓度，对其进行全面考察，最后对正交结构进行处理（表1），得到最优组合进行培养基优化试验。

　　2 结果与分析

　　2.1 最适生长温度的确定

　　温度是影响菌体生长增殖的重要因素之一，选择最适合菌体分裂代时最短或生长速率最高时的培养温度，是菌体增殖的重要方面[5]。本研究选择了4个温度，如图1所示，当发酵体系温度分别控制在30、35、37、40 ℃时，其各自达到的最大活菌数分别为1.32×108、1.38×108、1.32×108、1.02×108 cfu/mL。由上述试验结果可以得出，当F71在基础培养基中发酵培养，当发酵温度在35 ℃时，其活菌数最高可达到1.38×108 cfu/mL。

　　2.2 最适初始pH值的确定

　　在粪肠球菌的高密度培养过程中，发酵体系的初始pH值对粪肠球菌的活菌数和发酵活力有较大影响[6]。因此，通过试验确定F71发酵的最适初始pH值至关重要。本研究分别控制发酵体系的初始pH值为6、7、8和9；在发酵过程中于相应的时间点上取发酵液来测定活菌数，所得结果如图2所示，当初始pH值为9时，发酵效果较好，在发酵至35 h时，最高活菌数可到达1.39×108 cfu/mL，且呈现pH值越大，发酵效果越好的趋势，故pH值可作为一个因素进行下一步正交试验考虑。

　　2.3 最佳营养因子的添加

　　许多文献报道[7-8]，添加不同的营养因子对粪肠球菌的发酵增殖起到明显作用，本研究分别加入了5% 西红柿汁、5%胡萝卜汁、1%牛肉膏、0.2%柠檬酸铵、5%土豆汁、5%平菇汁、5%甘薯汁和1%玉米浆，并与未加入上述营养因子的培养菌进行比较，结果如图3所示。由图3可知，当培养温度在35 ℃，培养基初始pH值为9，添加柠檬酸铵、土豆汁和平菇汁均对菌体增殖具有促进作用，其中添加了0.2%的柠檬酸铵可以使活菌数最高达到1.88×108 cfu/mL，而西红柿汁、胡萝卜汁和玉米浆对菌体的生长有部分抑制作用，甘薯汁、牛肉膏的添加对菌株生长影响不明显。

　　2.4 不同铵盐对菌体增殖的影响

　　由上述可知，柠檬酸盐的加入，可以使活菌数明显提高，由此将添加不同的铵盐，进一步考察何种铵盐对菌体的增殖具有明显效果。选用氯化铵、乙酸铵、碳酸铵、磷酸氢二铵和柠檬酸铵，分别添加至基础培养基中，用量均为0.2%，在35 ℃、培养基初始pH值为9的条件下进行培养，结果如图4所示。由图4可知，铵盐的添加确实可以促进菌体的增殖，其中乙酸铵和碳酸铵的增殖效果最为明显，最高活菌数分别为2.18×108、2.14×108 cfu/mL，氯化铵和柠檬酸铵在5种铵盐中促生长的效果最差，但与空白对照相比仍有较明显的提高，最高活菌数都达到1.86×108 cfu/mL。

　　2.5 缓冲体系对菌体增殖的影响

　　粪肠球菌在培养过程中，1分子乳糖在乳糖酶的作用下分解成2分子的单糖，而后被粪肠球菌分解为4分子的乳酸，而乳酸的生产会导致发酵体系的pH值下降，在pH值降低至4左右时就抑制粪肠球菌的再次分裂，这时菌的对数增长繁殖就被破坏；如果pH值继续下降，则进入衰亡期，菌数减少，活力减弱，不利于菌体增殖。而利用缓冲溶剂的方法比较简单，价格便宜，只需在培养液中构建缓冲体系即可。缓冲体系的作用是为了中和培养过程中产生的酸，达到延长菌体对数期的目的[9]。本研究采用CaCO3∶NaCH3COOH为2∶5的比例加入培养基，即CaCO3 0.2 g和NaCH3COOH 0.5 g。结果如图5所示，由图5可知，加入缓冲体系的培养基可以大幅提高活菌数，最高活菌数达到2.23×108 cfu/mL，远高于空白对照组（1.79×108 cfu/mL）。

　　2.6 正交试验

　　通过上述试验可知，培养基的初始pH值、不同的营养因子、铵盐以及缓冲体系对F71的活菌数的增加具有明显的影响。为了更好地优化培养基配方，合理组合各个因素，本研究采用正交分析的方法，用L9（34）4因素（营养因子、铵盐、缓冲盐、pH值）3水平进行正交化试验。对得出的数据进行分析并且得出上述因素的最佳添加量[10-12]。基础培养基优化的正交试验结果（L9（34））见表2。从表2可以看出，4个因素对细菌增殖影响是：B＞C＞D＞A，即土豆汁的浓度对菌体密度影响最显著，缓冲体系次之，而培养基初始pH值的影响最小。对最优组合进行试验验证，理论上确定最优组合为A2B2C2D1，以此组合进行验证试验，1～9为正交试验9组的试验结果，0则为空白对照组，理论上的最优组合的确比其他组合的增殖效果好，说明用正交试验优选出的最佳组合符合实际情况，因此确定最优组合为A2B2C2D1。

　　3 结论

　　试验结果表明，F71增殖培养基的配比为：胰蛋白胨10 g/L，酵母粉10 g/L，葡萄糖10 g/L，无水氯化钙0.04 g/L，七水合硫酸镁0.019 2 g/L，磷酸氢二钾0.04 g/L，磷酸二氢钾0.04 g/L，磷酸氢钠0.4 g/L，氯化钠0.08 g/L，土豆汁50 g/L，碳酸钙1 g/L，乙酸钠10 g/L，碳酸铵2 g/L，乙酸铵1 g/L，溶解煮沸，冷却后加入半胱氨酸盐酸盐0.5 g/L，加蒸馏水定容至1 000 mL，调节pH值为9，最适培养温度为35 ℃。在最佳配比条件下，活菌数最高为2.78×108 cfu/mL，与基础培养基进行对比，菌体增殖率为54.6%。

　　4 参考文献

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